Introducción: La Hiperplasia Adrenal Congénita (HAC) por déficit de 21-hidroxilasa es una enfermedad genética de herencia autosómica recesiva, causada por mutaciones en el gen CYP21B. La detección de estas mutaciones permite el diagnóstico molecular y la identificación de portadores. Objetivo: Realizar el diagnóstico molecular de HAC mediante la detección de las mutaciones P30L, Intrón 2, del8pb y G318X. Materiales y Métodos: Se extrajo el ADN de muestras de sangre periférica de 111 pacientes. Se amplificó el gen CYP21B mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en dos fragmentos solapados (exón 1-6 y exón 3-10), a partir de los cuales se amplificaron los fragmentos correspondientes a cada mutación. Los productos de amplificación fueron digeridos con enzimas de restricción y sometidos a electroforesis en geles de agarosa o acrilamida. Resultados: De las 111 muestras analizadas resultaron negativas 58, mientras que en 53 (47,8%) se detectó al menos una de las mutaciones. La mutación P30L se detectó en 13 casos, la mutación del Intrón 2 en 37, la del8pb en 13 y la mutación G318X en 18.  En 15 de los casos se encontró más de una mutación, 9 de estos con la combinación P30L/Intrón 2/del8pb en heterocigosis. Conclusiones: Mediante el estudio de las mutaciones seleccionadas ha sido posible el diagnóstico molecular de casi el 50% de los casos recibidos. Se identificó la mutación del Intrón 2 como la de aparición más frecuente y se observó en un 28,3% de los casos positivos la presencia simultánea de más de una mutación.